Plasmid dan Penggunaannya dalam Rekayasa Genetika

A. Pengertian Plasmid Sebagai Vektor dalam Rekayasa Genetika

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut sebagai rekayasa genetika.

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :

a.       berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)

b.      dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti

c.       terdapat di luar kromosom

d.      secara genetik dapat ditransfer secara stabil

Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat diantaranya sebagai berikut :

1.      ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya

2.    mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang

3.  mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing

4.      memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang

 Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :

1.      plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan pBR 322

2.      plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid Ti 

Gambar plasmid pBR 322 dengan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar1.

Gambar 1. Plasmid pBR 322

Gambar plasmid pUC 19 dan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar2.

 

Gambar 2. Plasmid pUC 19

B. Kegunaan Plasmid

Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.

C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika

Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut :

1.     penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan untuk prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot

2.  bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel inang

3.  apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1

4.   langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai pada daerah potongannya

5.  plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid

D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid

Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa  bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:

1.      Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut

2.      Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya

3.      Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Perbedaan antara hasil pemotongan yang berupa sticky end dan blunt end dapat dilihat pada tabel 1. berikut ini.

 Berbagai contoh restriksi enzim yang mengenali pada situs pemotongan tertentu pada DNA dapat dilihat pada tabel 2.

 

Proses pemotongan DNA digambarkan pada gambar 3. berikut ini

 

Gambar 3. Pemotongan enzim restriksi pada DNA

E. Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:

1.     Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong

2.   penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3’OH dari utas satu dengan ujung 5’P dari utas yang lain

3.  Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu.

Gambar struktur enzim ligase dapat dilihat pada gambar 4 berikut ini :

  

Gambar 4. Struktur enzim ligase

Proses penyambungan DNA ligasi pada daerah pemotongan digambarkan pada gambar 5.

  

Gambar 5. Penyambungan DNA ligase pada potongan DNA

F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan Plasmid Rekombinan

Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut dengan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. Secara sederhana prosedur untuk menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut:

1.      menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu

2.      menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor

3.      pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzim restriksi semisal dari E. coli

4.      pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim restriksi yang sama yaitu E. Coli

5.  hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat ujung 3’OH dengan ujung 5’P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu

6.    terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh organisme transgenik

Gambar proses terbentuknya Plasmid rekombinan sebagai hasil penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat pada gambar 6 berikut ini.

  

Gambar 6. Penyambungan Plasmid dengan DNA asing

G. Plasmid Ti

Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning, akan tetapi ada suatu bakteri yaitu Agrobacterium tumefaciens yang dapat membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing atau penyebab tumor). Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil khususnya padi. Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti yang disebut dengan T-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman menyebabkan pertumbuhan sel-sel yang tak terkendali, akibatnya akan terbentuk tumor.

Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan diekspresikan dengan menggunakan sistem DNA tanaman. Dalam prakteknya ukuran plasmid yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada dalam satu sel Agrobacterium tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E. Coli. Selanjutnya plsmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens yang membawa plamid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.

 

Gambar. Plasmid Ti

Pemanfaatan plasmid Ti dalam rekombinan tumbuhan sudah banyak dimanfaatkan seperti plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk pembuatan tanaman kapas Bt yang tahan terhadap hama ulat. Ulat yang memakan tanaman akan mengalami kematian. Pemanfaatan plamid ini juga untuk meningkatkan produksi tanaman. Misalkan saja tanaman yang mengandung protein tertentu setelah direkayasa dengan menggunakan plasmid rekombinan ini. Sehingga pada saat makan tanaman ini sudah mengandung protein tertentu.

 

Gambar. Rekayasa tanaman dengan menggunakan Plasmid Ti

Dari gambar di atas dapat dijelaskan bahwa penggunaan plasmid Ti dilakukan dengan cara menyambung plasmid dengan DNA asing. Pemotongan DNA dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi kemudian masing-masing potongan dilekatkan dengan ligasi DNA terbentuklah plasmid rekombinan. Sebagai hasilnya plasmid rekombinan dimasukan dalam nukleus tanaman melalui fusi protoplasma dan plasmid rekombinan akan berfusi dengan inti tanaman. Protopalasma selanjutnya dikulturkan dalam media kultur jaringan kemudian setelah terbentuk tanaman, setelah itu tanaman ditumbuhkan pada habitatnya. Tanaman yang dihasilkan akan memiliki sifat tertentu sesuai dengan sifat DNA asing yang digunakan. Sehingga apabila kita memakan tanaman tersebut berarti telah mengkonsumsi protein tertentu. Sifat inilah yang mulai dikembangkan pada tanaman.